Alfonso Negro nacque a Brooklyn da genitori Angresi il 27 giugno del 1915. Dopo alcuni anni dalla sua nascita la famiglia decise di ritornare in Italia, ad Angri, dove visse la sua adolescenza, a soli 15 anni, nel 1930 iniziò a giocare a calcio nell'Angri, era un attaccante schierato prevalentemente come interno; a 18 anni ebbe il suo primo ingaggio nella Catanzarese, in Serie B, dove collezionò 23 presenze e 6 gol.

Le sue doti non sfuggirono agli osservatori della massima divisione e nel 1934 fu acquistato dalla Fiorentina del presidente marchese Ridolfi per una cifra, allora ritenuta folle, 40 mila lire. A Firenze il giovane attaccante visse gli anni più belli della sua vita. Ebbe amicizie con i più celebrati campioni dell’epoca: da Meazza a Piola, da Ferraris ad Orsi. Nel campionato di Serie A ‘34-35 mise la sua firma, con tre presenze, in uno dei migliori campionati disputati dalla squadra gigliata prima della guerra, chiudendo la stagione al terzo posto.

L'anno successivo Negro giocò altre tre partite, andando a segno contro la Lazio del grande Piola, a Firenze, tra il 1934 e il 1938, giocò 52 partite segnando 5 goal.

Sempre a Firenze iniziò la sua carriera da medico, frequentando l'Università di medicina ginecologica e ostetricia; nel 1936 venne selezionato per rappresentare l'Italia ai giochi olimpici di Berlino.

Chiamato dal Commissario tecnico Vittorio Pozzo (campione del mondo nel '34) che selezionò i migliori giocatori provenienti dal mondo universitario, il 10 agosto 1936 Alfonso Negro segnò un memorabile goal nella semifinale contro la Norvegia (2 a 1 per l'Italia)

L'Italia scese in campo con questa formazione: Venturini, Foni, Rava, Baldo, Piccini, Locatelli, Frossi, Marchini, Bertoni I, Biagi, Negro.

A Berlino il 15 agosto 1936 l'Italia affrontò l'Austria in finale, vincendo per 2-1, l'Olimpiade del 1936 è ancora oggi l'unica vittoria olimpica della Nazionale di calcio italiana.

Nella stagione 1938/39 passò al Napoli, nelle stagioni napoletane giocò 23 partite segnando 3 goal.

Nel 1940 si laureò in medicina, in quello stesso anno con l'entrata dell'Italia nella Seconda guerra mondiale, venne arruolato nell'Esercito come tenente medico, inviato sul fronte greco-albanese, prima nel 37° Battaglione mortai della Divisione Modena e poi negli ospedali da campo n. 209 di Gianina (Albania) e n. 316 di Atene, seppe farsi valere per le sue qualità professionali e umane. Durante la guerra seppe distinguersi nell'organizzazione di manifestazioni sportive per i soldati al fronte, organizzò un incontro di calcio tra il Regio Esercito e il Wehrmacht (Forze Armate tedesche) allo Stadio Panatenaico di Atene.

Nel dopoguerra continuò con la professione calcistica insieme a quella di ginecologo, approdò all'Ercolanese, rimase ad Ercolano fino al 1972, vivendo pienamente la vita sportiva, sociale, umana e politica della città, fu anche nominato assessore allo sport.

Negli anni '80 ritornò a Firenze, dove morì il 7 novembre 1984 a soli 69 anni d'età.